心肌炎常表现为心脏复杂的炎症反应，其常见的临床与组织学特点主要由变态免疫反应导致。心肌炎的病理学过程包括三个阶段：急性炎症期、亚急性炎症期、慢性心肌病期。虽然关于心肌炎的发病机制近年来有些许进展，但我们仍对心脏中复杂的细胞浸润特点知之甚少。不同类型的免疫细胞在该疾病的炎症反应发挥怎样的作用，仍然未知，同时也限制了药物的开发。
对此，国家心血管病中心、中医院宋江平团队运用单细胞测序技术，对不自身免疫性心肌炎的不同时期进行测序，挖掘在不同炎症阶段促进心肌炎的免疫细胞类群和基因特点。该研究的成果于年5月20日发表于心血管顶级期刊《circulation》中，题目为：Single-CellRNASequencingtoDissecttheImmunologicalNetworkofAutoimmuneMyocarditis。
结果解读：
研究使用肌球蛋白重链（α-MHC）注射建立小鼠自身免疫性心肌炎（EAM）模型，对急性炎症期、亚急性炎症期和心肌病期的小鼠心肌进行流式分选，最后运用10XGenomics平台对CD45+细胞进行单细胞测序。研究分析了个单细胞，鉴定出9个主要细胞群和26个细胞亚群，包括巨噬细胞（9个亚群），中性粒细胞（3个亚群），T细胞（5个亚群），NK细胞（1个亚群），B细胞（2个亚群），树突状细胞（3个亚群），天然淋巴细胞（ILCs,1个亚群），心肌细胞（1个亚群）和内皮细胞（1个亚群）。
Figure1：自身免疫性新疾病小鼠模型个细胞总体分群。
在EAM三个时期，巨噬细胞都为主要免疫细胞群（60%）。第二亚群为急性期的主要巨噬细胞群，于EAM第14天达峰，随炎症反应加重而升高，主要参与一氧化氮合成、吞噬小体形成和抗炎呈递功能。第三亚群主要存在于亚急性期，参与抗原呈递、细胞趋化和诱导单核细胞迁移作用。第八亚群调控防御反应，而第七亚群由M2型巨噬细胞组成，后者可能在心肌病期发挥作用，发挥炎症反应负调控和组织修复功能。作者运用单细胞调节网络推断和聚类分析（SCENIC）评估不同巨噬细胞亚群间基因差异受到哪些转录因子影响。结果表明
Bhlhe40,Nfil3,Mtf1,Esrra,Rnux3和Hif1a是调控第二亚群相关基因表达差异的转录因子，而Crem,Irf7,Bach2,Hif1a和Rxra为调控第三亚群的主要转录因子。
Figure2：巨噬细胞亚群特征
由于IL-1为心肌炎发病机制中的主要炎症因子，因此，作者对三个中性粒细胞亚群中的IL-1分别进行分析，发现第一亚群和第三亚群中IL-1α表达上调，IL-1β在三个亚群中，尤其是第一亚群中高表达。中性粒细胞第一亚群为急性期的中性粒细胞群，可分泌炎症因子IL-6TNF，其调控防御反应、中性粒细胞脱颗粒和炎症反应。而第二亚群中在MAPK通路和细胞骨架排布中起主要作用，其主要参与心肌病期。
Figure3：中性粒细胞亚群特征
研究并未检测到Th1及Th2相关细胞因子表达于任何T细胞亚群中，但发现在第二和第四亚群中存在Th17细胞因子的高表达。T细胞第一亚群为细胞*性T细胞，为正常心脏中常见的T细胞类群。第二亚群由大量Th17细胞组成，参与急性期炎症反应。第三亚群为调节性T细胞，参与亚急性炎症期的炎症反应调节。第四亚群为γδT细胞，主要分泌IL-17A和IL-6，参与心肌炎向心肌病的过渡转变。
Figure4：T细胞亚群特征
B细胞主要分为两个亚群，第一亚群为主要亚群，而第二亚群比例随EAM进展而升高。在EAM急性期，B细胞发挥抗原呈递和调节受体结合的作用。亚急性期，促进髓系白细胞迁移、炎症反应、细胞因子释放、淋巴系与非淋巴细胞的相互作用。而心肌病期，B细胞参与白细胞趋化、分化和对IL-4的免疫反应负调控。
Figure5：B细胞亚群特征
DC细胞主要分为3个亚群，第一亚群为不同时期中的主要细胞群，而第二和第三亚群在炎症期升高。值得注意的是，第三亚群在正常心脏中比例较低但在严重反应发生时升高，并随着疾病进展逐渐降低，该亚群参与抗原呈递、髓系细胞分化和细胞因子释放等过程。
Figure6：DC细胞亚群特征
在EAM中，IFN-γ来源于NK细胞，该类细胞在急性期比例升高，但在亚急性期比例降至最低，其主要参与适应性免疫反应与NK细胞介导的细胞*作用。
接下来，作者分析了炎症相关基因的特点。发现Hif1α在巨噬细胞第二亚群和Th17细胞中均显著表达，且在不同细胞亚群中表达量有显著差异，其表达水平与细胞炎症评分正相关。
因此，作者猜测Hif1α为EAM炎症反应过程中的关键转录因子。
Figure7：Hif1α在免疫细胞中的表达模式，与炎症的相关性
为验证该假设，作者建立EAM动物模型，以Hif1α相关抑制剂PX-于小鼠处死前7天对其进行腹腔注射。结果表明，该药物可明显降低急性期心肌白细胞浸润，且随着Hif1α表达降低，T细胞与巨噬细胞于急性炎症期的浸润也有所缓解。同样，在亚急性期和心肌病期，炎症反应也显著缓解。
最后作者采集来自自身免疫性心肌炎患者、扩张性心肌病患者的移植心脏标本与健康移植心脏标本进行比较。发现自身免疫性心肌炎患者心脏内HIF1A阳性细胞比例较后两者明显升高，部分T细胞、巨噬细胞和心肌细胞亦表现为HIF1A阳性。该结果表明，不仅在动物模型中如此，在临床标本中，HIF1A与自身免疫性心肌炎也具有明显关联，其或可作为自身免疫性心肌炎患者的新型治疗靶点。
Figure8：Hif1α抑制剂对EAM的影响
结论与启示：
该研究首次针对EAM不同阶段的免疫细胞谱进行单细胞测序，揭示了特定免疫细胞类型与不同疾病阶段的关系。其中Hif1α表达与炎症反应程度显著相关，且该转录因子的抑制剂PX-可减轻不同EAM阶段的炎症反应。除动物模型外，研究采用人类心肌炎标本进一步验证HIF1A与该疾病的临床关联，指出HIF1A有望作为自身免疫性心肌炎的新型治疗靶点。
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